生物分析专栏 | 内源性物质的生物分析策略及应用实例

内源性化合物即机体内天然存在的物质,这类物质会随机体代谢、生理调节等机体自身作用而发生改变,也可能因能量的摄入而发生规律性变化。

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肝肠循环[1]

从研究内源性物质着手寻求治疗疾病的药物成为新药研发的最主要途径之一,并且已取得了丰硕的成果,大量内源性物质药物应运而生,因此对内源性物质药物的定量分析越显重要。

FDA公布的口服内源性药物品种规格[2]

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然而,内源性物质的检测有其独特的技术难点。首先是空白基质的获取;其次是如何区分药源性与内源性,或者其他来源;此外,由于机体的自身稳定机制,使内源性物质通常稳定在一个相对狭窄的范围(或有一定的周期性波动)。因此,内源性物质的分析需要建立一套科学、可靠的定量分析方法。

内源性物质的分析目前主要采用四种分析方式,即:替代分析物法、替代基质法、标准加入法和背景扣除法。这四种分析方法分别采用真实基质、替代基质、生物样本和真实基质建立各自校准曲线,以此计算或折算内源性物质的浓度。

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内源性物质分析策略[3]

4种分析方法各有其优势和劣势,具体来说:

替代分析物法由于引入机体内不存在但经验证与内源性物质存在着恒定比例关系的替代分析物,因此较其他分析方法费用更加昂贵。但其优势显著,由于方法采用与生物样本一致的真实基质,可有效消除基质效应和回收率的差异。

替代基质法更实用、经济,但其组份与真实样本间存在一定差异,若不予以消除,则会因基质不同引起仪器响应的差异和提取回收率的差异。

标准加入法最大的优势在于使用生物样本自身建立校准曲线,不存在基质效应和回收率差异,同样这也是该方法的劣势——样本需求量大,检测耗时。

背景扣除法的优势在于其采用真实基质,此法可有效避免标曲样本与生物样本间存在的基质效应和回收率差异。但该方法需要额外处理数据,利用软件在扣除背景后,拟合回归方程,以此计算样本中内源性物质的浓度。

下面逐一介绍4种分析方法的操作原理和代表性案例。

替代分析物法

替代分析物法是使用稳定的同位素标记物作为替代分析物在真实基质中建立校准曲线,利用替代分析物与内源性物质间存在的恒定比例关系(响应因子RF),折算内源性物质的浓度。替代分析物的方法好比相似三角形,已知三边计算另一边。

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替代分析物法原理图[3]

替代分析物法需关注:替代分析物和内源性待测物应具有相同的理化性质,在仪器响应中应存在恒定的比例关系,且该比例关系不随时间和线性范围内浓度的变化而发生改变;二者应能够被仪器区分;另外,需证明替代分析物和内源性物质具有相同的基质效应和提取回收率。

以熊去氧胆酸及其结合态化合物分析为例做一介绍。

熊去氧胆酸是一种无毒性的亲水胆酸,能竞争性地抑制毒性内源性胆酸在回肠的吸收。通过激活钙离子和蛋白激酶C组成的信号网络,以及激活分裂活性蛋白激酶来增强胆汁淤积肝细胞的分泌能力,使血液及肝细胞中内源性疏水胆酸浓度降低,达到抗胆汁淤积的作用。熊去氧胆酸还能竞争性地取代细胞膜和细胞器上的毒性胆酸分子,防止肝细胞和胆管细胞受到更多毒性胆酸的损害。熊去氧胆酸具有细胞保护作用、膜稳定作用、抗氧化作用、免疫调节作用。

针对内源性物质熊去氧胆酸及其结合态化合物,可选用替代分析物法。使用熊去氧胆酸-d5、牛磺熊去氧胆酸-d5和甘氨酸熊去氧胆酸-d5作为替代分析物在真实基质中建立校准曲线,利用熊去氧胆酸-d5、牛磺熊去氧胆酸-d5和甘氨酸熊去氧胆酸-d5与内源性物质熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸和甘氨酸熊去氧胆酸间存在恒定的比例关系(响应因子RF),折算内源性物质熊去氧胆酸及其结合态化合物的浓度。

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熊去氧胆酸及总的熊去氧胆酸药时曲线图[3]

替代基质法

替代基质法是采用替代基质(或剥离基质)和内源性物质建立校准曲线,以此分析内源性物质的浓度。替代基质法需关注替代基质(或剥离基质)和真实基质应具有相同的基质效应和提取回收率。

以维A酸的分析为例做一介绍。

维A酸是体内维生素A的代谢中间产物,主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。用于治疗寻常痤疮、银屑病、鱼鳞病、扁平苔癣、毛发红糠疹、毛囊角化病、鳞状细胞癌及黑色素瘤等疾病。

针对内源性物质维A酸,可利用其光不稳定的特性,采用光照获取的剥离基质,此法可最大限度的保留血浆原有的组份,以此为基质加入内源性物质维A酸建立校准曲线进行定量分析。在证明替代基质与真实基质间具有相同的基质效应和回收率后,此法可用于生物样本中维A酸浓度的测定。

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维A酸药时曲线图[3]

再以左卡尼汀的分析为例做一介绍。

左卡尼汀是哺乳动物能量代谢中必需的体内天然物质,其主要功能是促进脂类代谢。它既能将长链脂肪酸带进线粒体基质,并促进其氧化分解,为细胞提供能量,又能将线粒体内产生的短链脂酰基输出。左卡尼汀可缓解因体内缺乏引起的脂肪代谢紊乱、骨骼肌和心肌等组织的功能障碍。

针对内源性物质左卡尼汀,可采用膜透过技术获取剥离基质,尽可能的保留血浆原有的组份,以此为基质添加内源性物质左卡尼汀建立校准曲线进行定量分析,在证明替代基质与真实基质间具有相同的基质效应和回收率后,此法可用于生物样本中左卡尼汀浓度的测定。

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左卡尼汀药时曲线图[3]

标准加入法

标准加入法是将待测的生物样本等分成若干份,除两份外(一份用于制备零浓度样本BK,另一份用于制备双空白样本DB),依次加入已知量但不同浓度的内源性物质和等量的内标,以此建立每个生物样本的校准曲线,该样本制备的校准曲线与X轴的负截距即为待测生物样本的浓度。

标准加入法需关注:方法中每一步骤操作的体系均应保持一致,以保证基质效应和提取回收率一致;BK样本与DB样本中内源性物质的响应差异不能过大;此外BA样本对内标的干扰和残留对下一个样本分析的影响也应被本方法所关注。

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标准加入法操作示意图[3]

以氨基葡萄糖的分析为例做一介绍。

氨基葡萄糖是一种重要的氨基己糖,由葡萄糖的一个羟基被氨基取代形成。氨基葡萄糖参与构造人体组织和细胞膜,是蛋白多糖大分子合成的中间物质,它可合成黏多糖、糖蛋白和蛋白聚糖,特别是合成那些关节软骨以及滑液分子的中间物,是人体及动物体内关节组织中糖蛋白的天然成分。随着年龄的增长,人体内的氨基葡萄糖的缺乏越来越严重,关节软骨不断退化和磨损。

宋敏团队于2012年发表的文章[4]即采用标准加入法测定了血浆和尿液中氨基葡萄糖的浓度。

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氨基葡萄糖药时曲线图[4]

背景扣除法

背景扣除法,是在含内源性物质的真实基质中添加内源性标准品,在扣除真实基质的背景响应后,与内源性标准品的添加浓度建立校准曲线,以此计算生物样本的浓度。

背景扣除法需关注:内源性标准品的加入量必须显著,建议添加量至少为真实基质中内源性物质浓度的20%;此外,不同批次的真实基质中内源性物质的浓度或存在差异,有可能对定量下限产生影响。

以烟酸的分析为例做一介绍。

烟酸又称尼克酸、抗癞皮病因子。主要存在于动物内脏、肌肉组织,水果、蛋黄中也有微量存在,是人体必需的13种维生素之一。烟酸和其衍生物烟酰胺,同属于维生素B族化合物,是人体中不可缺少的营养成分,在促进人体的正常生长发育上起着重要的作用。此外,烟酸可影响造血过程,促进铁吸收和血细胞的生成;维持皮肤的正常功能和消化腺的分泌;提高中枢神经的兴奋性和心血管系统、网状内皮系统与内分泌功能,等等。

Song Ying团队于2012年发表的文章[5]即采用背景扣除法测定了健康受试者血浆中的烟酸和烟酰胺的浓度。

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两种用药方式下烟酸及其衍生物烟酰胺的药时曲线图[5]

结语

随着内源性物质药物研发进程的推进,如何科学、准确、高效地对内源性物质进行定量分析将成为重中之重。此类分析在结合具体药物的性质及代谢特点的同时,应尽可能地减少非药物因素的影响,从而选择合适的分析方法,以支持临床前/临床药物研究。

另外生物标志物是内源性化合物研究的重要领域,它作为生化指标可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变,因此具有非常广泛的用途。例如:生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。生物标志物中小分子部分,其定量分析是否可以参考上述4种方法开展相应研究值得关注。

参考文献[1] T Lieu, G Jayaweera, N W Bunnett. GPBA: a GPCR for bile acids and an emerging therapeutic target for disorders of digestion and sensation [J]. British Journal of Pharmcology. 2014, Volume 171, Issue 5:1156-1166.[2] FDA网站,信息截止至2017年04月30日.[3] 阳光德美.[4] Min Song. Precolumn derivatization LC–MS/MS method for the determination and pharmacokinetic study of glucosamine in human plasma and urine[J]. Journal of Pharmaceutical Analysis 2012;2(1):19–28.[5] Song Ying. Pharmacokinetics of Single-Dose and Multi-Dose of Lovastatin/ Niacin ER Tablet in HealthyVolunteers[J]. Chromatography Research International, 2012, Article ID437075.

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