基因优化技术

基因转录翻译是一个复杂的过程,每一步都关系到蛋白质的最终表达,其中密码子使用频率、mRNA结构对蛋白表达有着重要影响,因此对其进行优化有助于提高蛋白质的表达效率[14]。德泰生物根据蛋白质表达过程中的影响因素,自主研发了MaxCodonTM软件对基因序列进行优化,从根本上保证蛋白表达的效率。

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蛋白质表达过程

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mRNA二级结构影响蛋白表达

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mRNA形成的二级结构越复杂越稳定,肽链的延长速率越低,翻译的效率和最终蛋白表达水平越低 [7],[11]。

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德泰生物通过同义密码子替换,减少了mRNA序列中的碱基配对,避免mRNA二级结构的产生,提高蛋白表达效率。

密码子偏好性影响蛋白表达

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上图是大肠杆菌ME-matrix基因对应异亮酸的密码子使用频率[15],可以看到对应异亮氨酸的不同密码子使用频率不同

德泰生物在优化密码子时,以宿主细胞使用频率高的密码子替换稀有密码子,提高蛋白质表达效率。

GC含量与核糖体结合位点影响蛋白表达

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GC含量

GC 含量通常间接对基因表达进行调控和影响,过低GC含量可能会导致转录终止,过高GC含量则容易使mRNA形成二级结构 [5] 。德泰MaxCodon 软件通过调节GC含量,解决这个问题。

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核糖体结合位点

核糖体结合位点是从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列,核糖体结合位点对形成翻译起始复合物是必需的[6]。类似的序列会造成翻译起始的紊乱。MaxCodonTM软件通过优化算法,有效避免这一情况发生。

案例

  • 优化密码子适应指数(CAI)

CAI的值越高,该基因与宿主细胞密码子偏爱性的符合程度就越高[10]。

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MaxCodonTM使用同义密码子替换的方法,在蛋白质序列不变的情况下,让目的基因的密码子使用频率尽量接近于E.coli。

  • 优化mRNA二级结构

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MaxCodonTM软件在进行同义密码子替换的同时进行mRNA二级结构的预测,减少mRNA二级结构的产生。

  • 基因优化前后的蛋白表达量

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经过MaxCodon™软件优化目的基因之后,a蛋白由不表达变为表达,b蛋白则在优化后表达量显著增加

名词解析

  • 密码子偏爱性

常用氨基酸有20种,对应的遗传密码子却有64种,密码子与氨基酸是多对一的关系。对应同一氨基酸的不同密码子被称为同义密码子。

同义密码子在不同生物体内的使用频率是不同的,那些被频繁利用的称为最优密码子(optimal codons),那些不被经常使用的称为稀有密码子(rare or low-usage codons)。用于生产蛋白的原核生物例如最常见的E.coli都表现出对于同义密码子的不同使用频率,也就是所谓的密码子偏好性[9]。

密码子偏爱性影响tRNA的丰度, 由于tRNA是mRNA翻译成蛋白质的直接执行者, tRNA的多少与蛋白质表达的效率直接相关,因此在优化密码子时将目的基因中的稀有密码子替换成宿主细胞常用的密码子,能够有效提升表达效率。

  • 相对同义密码子使用度(RSCU)[9]

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公式中, xij是编码第i个氨基酸的第j个密码子的出现次数, ni是编码第i个氨基酸的同义密码子的数量(值为1~6)。

  • 密码子适应指数(CAI)[10]

密码子适应指数用于表示同义密码子与密码子最佳使用相符合的程度,取值范围在0—1之间,如果越高则表明该基因的密码子使用偏好性越强,公式如下:

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其中wk(The relative adaptiveness of a codon)表示密码子相对适应度,L是指基因中所使用的密码子数,密码子相对适应度,公式如下:

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参考文献

1. Slonczewski J L, Foster J W. Microbiology: An Evolving Science[M].

2. Tabor S, Richardson C C. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1985, 82(4):1074-8.

3. Pallarès I, Ventura S. The Transcription Terminator Rho: A First Bacterial Prion.[J]. Trends in Microbiology, 2017.

4. West S, Proudfoot N J. Transcriptional Termination Enhances Protein Expression in Human Cells[J]. Molecular Cell, 2009, 33(3):354-364.

5. Baca A M, Hol W G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.[J]. International Journal for Parasitology, 2000, 30(2):113-118.

6. Agaisse H, Lereclus D. STAB‐SD: a Shine–Dalgarno sequence in the 5′ untranslated region is a determinant of mRNA stability[J]. Molecular Microbiology, 1996, 20(3):633-43.

7. Yang J R. Does mRNA structure contain genetic information for regulating co-translational protein folding?[J]. 动物学研究, 2017, 38(1):36-43.

8. Ikemura T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms[J]. Molecular Biology & Evolution, 1985, 2(1):13-34.

9. Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Codon bias and heterologous protein expression. Trends Biotechnol, 2004, 22(7): 346―353.

10. Sharp PM, Li WH. The codon Adaptation Index–a meas-ure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications. Nucleic Acids Res, 1987, 15(3): 1281―1295.

11. Tuller T, Waldman YY, Kupiec M, et al.Translation efficiency is determined by both codon bias and folding energy. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(8): 3645−3650.

12. Williams E, Place A, Bachvaroff T. Transcriptome Analysis of Core Dinoflagellates Reveals a Universal Bias towards “GC” Rich Codons.[J]. Marine Drugs, 2017.

13. Bulmer M. Coevolution of codon usage and transfer RNA abundance[J]. Nature, 1987, 325(6106):728.

14. Lu Y, Fang C, Wang Q, et al. High-level expression of improved thermo-stable alkaline xylanase variant inPichia Pastoristhrough codon optimization, multiple gene insertion and high-density fermentation:[J]. Scientific Reports, 2016, 6:37869.

15. Thiele I, Fleming R M T, Que R, et al. Multiscale Modeling of Metabolism and Macromolecular Synthesis in E. coli and Its Application to the Evolution of Codon Usage[J]. Plos One, 2012, 7(9):e45635.

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